1, 寡核苷酸探针杂交的分子基础是什么?
watson,crike的DNA双螺旋模型。如果是填空什么的这就够了。如果是论述大题的话(这个题目还不算大),我这里就不具体论述了简单的介绍一下论述思路吧。(毕业多年,好久没学习了,具体的也说不太清楚了。唯记得上学的时候论述DNA双螺旋模型是整个分子生物学的基础一题,貌似还基本拿了满分)首先:什么事寡核苷酸探针杂交,分子过程。这样就可以为论述其分子基础提供背景和素材;其次:将DNA双螺旋模型是什么,有什么内容,太精确的不记得了,大致记得是可分为3点,1. 核酸单链,2. 两条链(不是3条或几条链聚合,双螺旋模型之前确实有人提出了DNA存在形式的3链结合模式),同时碱基互补配对;3. 扭转折叠成双螺旋结构;最后:将DNA双螺旋模型和寡核苷酸探针杂交相结合,杂交过程都是以双链互补结合为基础的;
2, 基因探针的探针标记
荧光共振能量传递 (FRET) 某荧光标记基团在激发光刺激下生成某波长的发射光,当另一屏蔽基团与其距离合适时,原发射光将会被屏蔽基团所吸收,并转化为其他波长的发射光或热能,称之为FRET。 2.荧光化学: 荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种:荧光探针和荧光染料。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5"-3"外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。 二.实时荧光PCR技术靶基因的确定及引物和探针的设计原则 1.靶基因的确定:选择检测组共有的基因以避免检测的假阴性(漏检)。 2.检测片段的确定:选择检测组内的保守 (突变少)(避免假阴性)、组间特异的序列 (突变多)(避免假阳性)作为引物探针的设计位置。片段长度70-150bp。 3.引物:长度17-25bp;GC含量30-80%;退火温度(Tm值)58-60℃;避免稳定的引物二聚体(特别是多联检测)及发夹结构(自由能大于-3.5kc/m);序列不能出现连续的G,3"端避免G或C,最后5个碱基内避免两个以上的G或C。 4.探针:长度20-30bp(Taqman)或16-25bp(MGB);GC含量30-80%;Tm值为68-70℃;避免稳定的二聚体及发夹结构 (自由能大于-3.5kc/m);5"端不能是G;位置尽量靠近上游引物;选择波长差异较大(多联检测)或Fam(单联检测)的荧光标记。 三.特点和优势 1.特异性强:引物和探针的“双保险”,避免检测的假阳性。 2.灵敏度高:分析PCR产物的对数期,自动化仪器收集荧光信号,避免了许多人为因素干扰。 3.避免污染:全封闭反应,无须PCR后处理。 4.实现定量:运用标准品获得标准曲线,结合Ct值进行准确定量。 5.高效低耗:可实现一管多检。 6.操作简便:在线式实时监测扩增结果,不必接触有害物质。 7.快速:反应时间四.实用意义: 1.提高检测效率,缩短检测周期,提高通关速度; 2.降低检测成本,提高经济与社会效益。
相关概念
探针
探针是一小段单链DNA或者RNA片段(大约是20到500bp),用于检测与其互补的核酸序列。双链DNA加热变性成为单链,随后用放射性同位素(通常用磷-32)、萤光染料或者酶(如辣根过氧化物酶)标记成为探针。磷-32通常被掺入组成DNA的四种核苷酸之一的磷酸基团中,而荧光染料和酶与核酸序列以共价键相连。